生物制藥的培養基選擇及檢測方法
發布時間：2022-07-15 瀏覽次數：2225
近幾年隨著我國生物醫藥的發展，行業市場需求增長穩定。培養基作為生物制品生產的重要原材料之一，其質量對生物制品有重要的影響。細胞培養基的生產工藝和細胞培養基的原材料選擇、生產過程及檢驗過程中的質量控制對于細胞培養基的產品質量具有直接影響。
細胞培養基選擇及檢測
一直以來國產培養基之路比較崎嶇，隨著國內部分培養基供應商在培養基的研發及生產方面投入了越來越多的精力，很多優秀的產品也逐漸超越進口品牌成為主流，這也讓我們看到了國產品牌的希望。
隨著越來越多的國內生物公司通過中美雙報，中歐雙報走出國門，倒逼國內培養基的研發和制造與國際標準接軌。因此在工藝風險評估中，對培養基進行必要的檢測方法能有效保證產品的質量及安全性。
培養基檢測方法：
澄清度檢查法：澄清度是檢查藥品溶液的渾濁程度，溶液中如若存在細微顆粒，當直射光通過溶液時，可產生光散射和光吸收的現象，致使溶液微顯渾濁，所以澄清度可在一定程度上反映藥品的質量和生產工藝水平。
細胞培養基中的營養成分只有完全溶解于水才能被細胞吸收攝取，細胞才能生長增殖，因此培養基是否溶解以及培養液是否透明澄清直接影響培養基使用。通過對水溶解后的培養基的澄清度檢查，能夠判斷細胞培養基的溶解性。此法是用規定級號的濁度標準溶液與供試品溶液比較，以判定細胞培養液的澄清度或其渾濁程度。
pH值測定方法：各種細胞的正常功能及一切生物化學反應，都是在適當和穩定的酸堿環境下進行的，因此細胞培養基的pH值是細胞生長的重要參數，pH值偏低或偏高都會影響細胞生長。
在工業化使用時，由于傳統的細胞培養基中含有pH指示劑如酚紅等，通常依據“眼睛”觀察培養液顏色來判定pH，或是簡單的使用pH試紙測定，但是上述方法存在較大的主觀因素，影響正確判定，并且在配制的過程中，不同區域還可能存在一定的水質區別等，通過使用pH儀器檢測可以消除人的主觀判斷，準確性更高。此外，在檢測過程中，添加碳酸氫鈉后的培養基在測定的過程中，暴露在空氣中的時間也會對所測pH的準確性有一定的影響。
2020年版《藥典》對培養基的要求，應確定每批培養基滅菌后的pH值（冷卻至25℃左右測定）。若培養基處方中未列出pH值的范圍，除非經驗證表明培養基的pH值允許的變化范圍很寬，否則，pH值的范圍不能超過規定值±02。如需滅菌后進行調整，應使用滅菌或除菌的溶液。
干燥減量測定方法：細胞培養基具有吸濕性，在空氣中放置時水分會很快升高，干燥減量表示產品中的含濕量。細胞培養基是有菌制劑，其豐富的營養成分有利于微生物生長，保持培養基中的低水分含量可以有效防止微生物的繁殖。
檢測細胞培養基中水分的含量采用的方法是干燥減量法。該測定方法是依據中國藥典2010年版二部附錄Ⅷ L 干燥失重測定法制定，具體是指產品在規定條件下干燥后所減失重量的百分率。減輕的重量主要是水分、結晶水及其他揮發性物質等。由減失的重量和取樣量計算供試品的干燥失重。
滲透壓：通常動物細胞必須生活在等滲環境中，借助K＋、Na＋維持滲透平衡。雖然大多數細胞對滲透壓具有有一定的耐受性，但是培養液滲透壓過高容易使細胞脫水萎縮，培養液滲透壓過低容易使細胞膨脹破裂，控制培養基的滲透壓范圍對于細胞培養具有重要的作用。
檢測通常采用冰點滲透壓儀進行，當供試品溶液的毫滲透壓摩爾濃度太大或大于儀器的測定范圍時，用適宜的溶劑稀釋至可測定的毫滲透壓摩爾濃度范圍。
細菌內毒素檢測方法：細菌內毒素是許多病原性細菌所產生的毒素。細胞培養基中細菌內毒素過高，對生物制品的質量如純度、引起副反應等方面有影響，而且會降低生物制品的產率。
細菌內毒素檢查法通常利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。其檢查包括凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。通常當測結果有爭議時，以凝膠法結果為準。
微生物限度：細胞培養基不是無菌產品，其中的微生物在一定條件下會吸收培養基中的營養物質滋生繁殖，導致培養基變質失效。控制細胞培養基中細菌和霉菌，是延長培養基有效期的方法之一，對其的檢測是非常必要的。
細胞生長實驗：細胞在體外進行培養時，失去了機體的調節和控制作用，因此，細胞培養液除滿足細胞的營養要求外，還必須使其生存環境接近活體的環境。其中培養液及外環境的培養條件如溫度、滲透壓、酸堿度等均能影響細胞的生長。
細胞培養基的功能就是滿足細胞體外生長增殖需求，因此細胞培養效果的檢驗是產品質量優劣的一個直觀表述，是必檢項目，這也是一個產品性能特性表述的要求。
培養基的選擇：
選擇合適的細胞培養基用于建立上游工藝是生物制劑開發中的重要步驟，作為制藥企業等終端培養基用戶，可以選擇針對自身工藝平臺開發定制化培養基，也可以選擇現成的商品化培養基。
目前培養基供應商針對不同的細胞培養模式和生產平臺，可提供多種商品化培養基供生物工藝開發使用。市場上無血清培養基品牌和種類眾多，尤其目前應用最為廣泛的治療性抗體生產的 CHO 細胞培養基。在大規模生產工藝中，在眾多選擇中篩選合適的培養基是工藝建立的基礎。
確定侯選培養基來源及范圍：對供應商的現場審核和驗證，培養基產品質量，批次穩定性和再現性，價格和客戶服務等多種因素決定培養基供應商是否可被接受。選擇經過多年市場驗證的，知名品牌培養基供應商的商品化培養基，用于初步篩選可以省去此部分調查的人力、資金及時間的投入。更重要的是，可以減少或避免藥物申報中的監管風險及保證藥物上市后的培養基的供應安全。
培養基性能和表現評估：細胞在不同的生產階段對營養成分的需求不同，基礎培養基通常先要保證細胞接種后能夠順利生長，而有些更利于細胞產物表達的成分可能會對細胞生長具有抑制作用，基礎培養基和補料的有機搭配，才能獲得最佳細胞生長和表達效果。因此，先篩選出基礎培養基，再進行搭配補料的篩選，往往會漏掉非常具有潛力的基礎培養基。
用于建立培養工藝的細胞株通常是培養并凍存于某種特定培養基中的，細胞可能會對該培養基中的某些特定成分，或者該培養基的營養成分配比產生依賴，更換至另外的培養基中細胞可能會因為不適應而不能給出客觀真實的結果。
將工程細胞克隆適應至候選培養基中是進行培養基篩選的第一步，也是非常重要的一步。細胞適應后是在小規模對這些培養基的培養表現進行評估，比如說單位產量，產品質量、產物穩定性，純化應用性能和理化性能（例如剪切損傷、泡沫、沉淀，酸堿度控制，代謝廢物積累等）。
適應性評估：驗證工作可以在能夠代表最終生產體系的Scale-down模型上，測試和驗證培養基的性能表現、多批次培養基的性能一致性等，必要時還需要測試培養基在生產規模上的性能表現，才能夠最終確定培養基。
