《食品科學》：中國檢驗檢疫科學研究院吳亞君研究員等：食源性致病菌快速檢測技術研究進展
發布時間：2022-07-18 瀏覽次數：1874
近年來，隨著食源性疾病的暴發，食源性致病菌成為影響食品質量與安全的首要因素，食品從原材料生產到最終消費都可能通過與水、空氣、土壤、肥料及食品加工環境的接觸而被病原體污染。
因此，為了確保食品安全，在將食品投放市場之前，使用可靠、有效的方法檢測病原菌至關重要。簡便、特異、靈敏、低耗且適用的快速診斷及檢測食品中致病微生物的方法被廣泛應用。近年來，食源性致病菌快速檢測技術獲得了很大的進展，長春大學食品科學與工程學院的王丹丹、吳淑清*和中國檢驗檢疫科學研究院的吳亞君*等人就目前常用微生物快速檢測技術的應用和研究現狀作總結概述，以期對我國食品快速檢測領域的發展提供參考。
01 食源性致病菌快速檢測技術的分類
顯色培養基技術
定位顯色培養基是一種基于生化反應的微生物鑒定技術，其原理是根據不同微生物胞內酶反應條件的差異作為分類鑒定的依據，在分離培養基中加入特定的底物，這些底物由微生物可代謝的物質及發色基團組成，在微生物特異性酶的作用下，發色基團游離并顯色，通過觀察菌落的顏色就能夠對菌種進行鑒別。
ATP發光法
ATP發光法是一種快速且便捷的操作技術，只需要幾分鐘便可以得到檢測結果。ATP在細胞代謝中起重要作用，其含量可以直接代表活細胞數，原理是將細菌中的ATP提取出來，和熒光素酶、氧氣、鎂一同和蟲熒光素發生反應產生熒光，通過反應產生的熒光推測計算其ATP的含量，從而得到所測樣品中細菌的含量。目前，ATP發光技術在大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等致病菌的檢測中得到了應用。
免疫學技術
酶聯免疫吸附試驗技術
酶聯免疫吸附試驗（ELISA）技術是用酶標記表面吸附抗原或抗體的固相載體，其與相應的抗體或者抗原相結合，形成帶有酶標記的復合物，得到的攜帶酶的復合物可與特定底物反應產生顏色變化，通過對該產物的定量分析，從而達到檢測目的，抗體是確定ELISA靈敏度和特異性的關鍵因素。
免疫熒光技術
免疫熒光技術是采用熒光素標記已知抗原或抗體，與特異抗體或者抗原結合后產生熒光的原理實現檢測目標致病菌的目的。Ozeh等將免疫熒光技術與光電動力學技術相結合用于水中大腸桿菌的檢測和定量，并在4 h內檢測限達到104 CFU/mL。較傳統ELISA而言，該技術檢測時間更短，靈敏度更高。但該技術判定結果的操作過程較繁瑣，且需要專業人員操作，因此在食源性病原菌檢測方面應用較少。
膠體金免疫層析技術
膠體金免疫層析技術（GICA）是以膠體金作為標記物檢測特定抗原或抗體的免疫標記技術，其以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，待測物受體與樣品反應，產物被聚集到層析材料的某一位置，通過膠體金可直接觀察實驗現象。
分子生物學技術
聚合酶鏈式反應
聚合酶鏈式反應（PCR）檢測技術中實時熒光PCR和多重PCR技術在快速檢測中的應用比較廣泛，其中實時熒光PCR技術是在PCR反應體系中加入了熒光基團，在反應過程中隨著熒光信號的積累來實時監測PCR反應進程，最后通過標準曲線來定量分析樣品中的待測成分。相比于傳統PCR技術，實時熒光定量PCR技術能實現實時對待檢成分進行定性、定量分析，省去電泳步驟，節省了時間。
等溫擴增技術
1）環介導等溫擴增技術：環介導等溫擴增技術（LAMP）是針對靶基因的6 個區域設計4 種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶、60～65 ℃恒溫條件下在體外擴增核酸的技術。王瑾根據沙門氏菌invA基因序列設計了特異性引物，建立了沙門氏菌LAMP檢測方法，該方法檢測僅需45 min，靈敏度達到6 CFU/mL。LAMP技術也被運用到創傷弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測。
2）重組酶聚合酶擴增技術：重組酶聚合酶擴增技術（RPA）是另一種新穎的等溫擴增技術，由特定的重組酶、單鏈結合蛋白和DNA聚合酶結合，在常溫條件下進行反應，5～20 min即可獲得與LAMP一樣的檢測結果。
3）滾環擴增技術：滾環擴增（RCA）技術是DNA分子以滾環式復制的一種恒溫擴增技術，其關鍵在于構建一個完整的單鏈DNA環用于后續擴增，RCA主要有線性RCA、超分支RCA和多引物RCA。Hao Liling等設計了金黃色葡萄球菌的RCA反應，反應中產生的單鏈DNA用于捕獲反應中形成的游離復合物，從而較少量的復合物吸附在納米材料上，保持原有化學發光，實現信號放大，結果表明在最優條件下該方法對純培養的金黃色葡萄球菌的檢測限可達15 CFU/mL。
基因芯片技術
基因芯片技術（DNA chip）又稱DNA芯片、DNA微陣列技術，其主要利用核酸分子雜交，是通過基因芯片上固定的已知序列的核酸或核酸片段去確定被檢測的DNA樣品，因其通量高、自動化程度高等被廣泛應用在各個領域。
微流控芯片技術
微流控芯片技術（microfluidic chip）又稱為芯片實驗室，結合分析化學、微機電加工技術、微管道網絡、生命科學等多個技術，其將樣品制備、反應、分離、檢測等多個步驟集成到一張芯片上，較基因芯片大多只能使用一次而言，微流控芯片能夠多次使用，因此更有發展前景。其通常借助光學方法或熒光信號檢測將擴增的DNA可視化。
高通量測序技術
二代測序技術實現了對全基因組的研究，把DNA測序引入到高通量測序時代，但是二代測序技術讀長過短、易引入PCR擴增錯誤且具有堿基GC偏好性，因此三代測序應用而生，與二代測序的邊合成邊測序相比，三代測序不需要進行PCR擴增，避免PCR擴增引入錯誤，同時第三代測序具有更高的通量和測序效率。
生物傳感器技術
生物傳感器是由生物感受器和換能器兩大部分組成的分析裝置，檢測微生物時主要利用抗原（抗體）以及各種敏感酶、生物堿和基因序列等，若待測樣品與以上物質反應，便會產生生物相互作用，隨后信號轉換器可將其轉化為一些可測量的電信號，再由信號放大器進行讀取檢測。通常用于快速檢測食源性病原體的生物傳感器有光學生物傳感器、電化學生物傳感器以及機械生物傳感器。
流式細胞技術
流式細胞技術（FCM）是基于細胞直接計數的一種微生物快速檢測方法，流式細胞計數裝置一般包括液流系統、光學系統、信號收集與轉換系統、分析系統。其使用激光對通過激光束的顆粒進行計數，從而實現細胞的定量觀察和定性分析，當顆粒或者細胞通過激光束的時候，會對光線產生折射和反射，此信號被探測器記錄下來，每通過一個細胞，就會產生一個峰值，最后根據峰值的個數得到細胞的數值。FCM對食品中的活菌數直接進行檢測，速度快，無需增菌，可在90～100 min內出具檢測結果；靈敏度高，甚至可檢測出1 個活的微生物或活細胞；該檢測技術適用于水、液態加工食品、飲料、化妝品及藥品等行業。
光譜技術
隨著光學儀器、光學技術以及計算機技術的快速發展，光譜檢測技術得以快速發展，拉曼光譜技術和表面增強拉曼光譜技術、傅里葉變換紅外光譜技術被廣泛用于微生物的快速檢測。拉曼光譜技術是通過測定代謝分子反應物質分子內部化學鍵的情況，從而確定微生物的種類。
質譜鑒定技術
質譜技術是一種根據離子產生的質量圖譜來確定樣品中分子組成的分析技術。質譜技術不僅可以對傳統的目標分析物進行定性和定量分析，還可以用于細菌的快速準確鑒定。在微生物的分析中，通過單個質量峰對微生物進行鑒定，從而實現微生物鑒定的快速性和有效性，其檢測過程高度自動化，極大加強了其簡便性與應用廣泛性。微生物檢測常用的質譜技術主要包括氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）、液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS）、基質輔助激光解吸飛行時間質譜（MALDI-TOFMS）及電噴霧質譜（ESI-MS）等。
02 結 語
近年來，已開發出許多檢測食源性病原體的方法，以解決食品安全和公共衛生問題，特別是隨著對新鮮食品和短保質期食品的食用不斷增加，快速檢測技術更具市場，眾多學者在不同快速檢測技術上都不斷革新，在檢測時間、靈敏度以及準確度上都有了很大的提升，但也還存在著不足，需要國內外研究者不斷地完善和改進現有的檢測技術。
一方面，幾乎所有的快速檢測技術都存在靈敏度不足的缺點，因此還需富集、培養等過程才可以得到檢測結果，免疫磁分離技術是一種經常被用在前處理過程中以提高檢測靈敏度的技術，其已成功用于富集和分離多種病原體，可以有效消除樣品基質中的聚合酶抑制劑，從而在檢測致病菌時縮短了富集時間并提高了靈敏度。快速檢測技術發展的方向應符合食品安全檢測的要求，實現高精度、高效率、低成本方式在線監測病原體。
另一方面，人工智能、基因編輯、納米技術等前沿學科融入到食源性致病菌的快速檢測，也將成為未來的發展趨勢。同時，在檢測過程中，還可以根據檢測要求選擇適當的技術，并且可以嘗試將未來多學科交叉結合使用，發揮各學科的優勢，并實現優勢互補，從而提高檢測的靈敏度、增加檢測準確性、縮短檢測時間。
另外，國內現行的標準幾乎沒有針對食源性致病菌快速檢測的方法，無法滿足檢測和監管的需求，因此還亟待制定一系列快速檢測技術的國家標準、行業標準、地方標準等，彌補快速檢測標準缺乏的現狀。
本文《食源性致病菌快速檢測技術研究進展》來源于《食品科學》2022年43卷3期276-285頁，作者：王丹丹，劉鳴暢，楊艷歌，王洪越，袁飛，吳亞君，吳淑清。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201105-048。
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