Milonese新作丨《GB 4789.2-2022 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》文本變化情況初探
發布時間：2022-10-12 瀏覽次數：9567
GB 4789.2-2022標準變更初探
菌落總數測定是食品微生物檢驗中應用得最為廣泛一個檢測方法，其國標方法文本屢經修訂，不斷完善。歷經了1984版、1994版、2003版、2008版、2010版、2016版到今天的2022版，在38年間已經陸續修訂發布了7個版本，平均5年修訂一次，這應該是GB4789系列里之最了，恐怕在國家標準中也不多見，足見其重要性。
即將實施——：
《GB 4789.2-2022 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》于2022年6月30日發布，將于2022年12月30日起正式實施。在這半年的新舊版過渡期內，廣大食品檢測機構應組織技術人員深入學習和理解新舊標準文本的差異，并進行必要技術性驗證。以下就是筆者對新版標準文本變更的一些粗淺認識，希望達到拋磚引玉的效果。
作為一個應用廣泛、檢測頻次較高的方法標準，其細微的變化都會引起業界的關注，尤其是某些重大的變化甚至還可能會帶來一系列的連鎖效應。總的來說，新版標準再次引入了測試紙片法，這應該是一個突破，預示著今后國標方法體系對于傳統方法的可能會有更多的補充，此外還增加了菌落計數范例，完善了一些文字方面的細節，進一步增強了方法標準的可操作性、實用性、靈活性。
設備材料
將3.3中原來的“恒溫水浴箱”修改為“恒溫裝置”，擴大了適用范圍，便于實驗室靈活采用各種適宜的保溫方式，并將溫度范圍由“46℃±1℃”改為“48℃±2℃”，以呼應后文中設備和溫度范圍的變化。在實際應用中，很多實驗室在恒溫水浴箱之外可能還采用了專用的培養基液化保溫裝置等設備，新標準修訂之后賦予了這些補充手段的合規性。無論采用怎樣的等效手段，實驗室一定要重視保溫裝置的溫度校準和日常監控、維護保養。
培養基和試劑
（一）增加了“4.2菌落總數測試紙片：應符合GB4789.28中平板計數培養基質量控制要求，且主要營養成分與平板計數瓊脂培養基配方一致”。
1、相較于傳統的平板傾注法，測試紙片法具有易用、便捷、高效、不具熱損害的優點，測試紙片法首次出現在2008版并作為第二法，但僅在兩年后即在2010版中被刪除。而類似的《SN/T 1897-2007 食品中菌落總數的測定 Petrifilm?測試片法》比2008版更早發布實施，但也已于2015年被廢止，給出的理由是“方法涉及試劑盒，未經評估”。[1]目前涉及紙片法的現行有效的行業標準《SN/T 4544.1-2016 商品化試劑盒檢測方法 菌落總數 方法一》以及即將實施的《SN/T 4544.2-2022 商品化試劑盒檢測方法 菌落總數 方法二》，明確了測試紙片的商品化試劑盒性質。然而，這次修訂的文本并未將測試紙片法作為第二法來呈現，可能也還是出于審慎的態度。
2、測試紙片“主要營養成分與平板計數瓊脂培養基配方一致”即指符合附錄A.1的PCA主要成分，包括：胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖，至于其他成分如顯色劑、冷凝膠等各品牌配方可能會有差異。實驗室應要求廠家提供配方證明文件，并作比較確認。
3、至于測試片的技術性驗收，如果參照現行的GB 4789.28可能不具可操作性，因為需要進行劃線測定生長率，鑒于測試紙片的物理性狀可能不太適合，只能等待新版的GB 4789.28正式發布。目前可供參考的是《SN/T 4544.1-2016 商品化試劑盒檢測方法 菌落總數 方法一》和《SN/T 4544.2-2022 商品化試劑盒檢測方法 菌落總數 方法二》附錄中的評價方法。該附錄參照《SN/T 2775-2011 商品化食品檢測試劑盒評價方法》要求，評價了特定品牌測試紙片與國標法的線性關系及準確度、耐變性、批間差異，并進行了實驗室間驗證試驗。程序比較復雜，工作量較大，對于一般的實驗室可能較難完成。
（二）將老版的“生理鹽水”和“磷酸鹽緩沖液”均加上了“無菌”作為定語修飾，與后文6.1中的描述呼應，也進一步強調了無菌操作。
（三）測試紙片的相關知識[2]
1、檢測原理：測試片主要由培養基、冷水可凝膠、顯色劑組成，菌落總數大多數用的顯色劑是TTC。細菌在測試片上生長時，細胞代謝產物與濃度極低的指示劑TTC發生氧化還原反應，將指示劑還原成紅色產物，從而使細菌著色。所以，大多數測試片上紅色菌落判斷為菌落總數。
2、適用范圍：由于操作簡單，被廣泛使用于加工過程菌落總數快速測定。適用于大部分食品及環境涂抹樣本，適用范圍較廣泛。
3、常見品牌：目前市場上的主流測試片形式有測試片和測試板，測試片又分冷水可溶性凝膠的和無紡布兩種，測試板多為板上加無紡布的形式。常見的進口品牌包括美國3M、美國Charm、日本DNP、德國默克等，國產品牌有陸橋、環凱、美正等。
4、常見的問題
① 出現菌落蔓延、水化現象。冰淇淋、糕點、加工肉制品、調味料等食品中的芽孢桿菌易發生液化現象，可以通過減少堆疊數量或者進一步稀釋來解決。
② TTC作為指示劑是否會抑制菌落的生長？測試片添加的極低濃度TTC不足以對多數常見微生物造成抑制，此外多數測試片的工藝采取的是分層涂布，TTC位于最上層，因此只有當菌落凸出之后才能接觸到低濃度TTC。
③ 顏色較深的樣品可能會有干擾，部分辛辣調味料會有干擾抑制，可選擇合適的稀釋倍數或帶濾網的均質袋進行樣品處理，具體依據各廠家的技術聲明來執行。
④ 開封后測試片保存方式。密封夾密封后，常溫/冷藏、避光、干燥保存，并于1個月內使用完。如果從冰箱中取出后要常溫放置一段時間再打開使用以防止冷凝水的產生。
檢驗程序
主要是對“圖1 菌落總數的檢驗程序”增加了一些注釋性文字：
1、將“2個~3個適宜稀釋度”改為“1個~3個適宜稀釋度”，與后文“6.1.5”的改動保持一致。
2、“培養”框之下的箭頭旁增加“36℃±1℃，48h±2h”和“水產品30℃±1℃，72h±3h”的文字描述。
操作步驟
（一）樣品的稀釋
1、6.1.1和6.1.2中提及的“生理鹽水”和“磷酸鹽緩沖液”均增加了“無菌”作為修飾定語。
2、6.1.2 中增加了“或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min~2min”明確了液體樣品允許使用均質器進行均質，這是符合現實需要的改變。此外，還增加了“如果結果單位為g的時候按6.11取樣方式前處理”的描述，解決了冰塊、冰淇淋等固體樣本融化后取樣方式的困擾。
3、6.1.3 中將“振搖試管或用1支無菌移液管反復吹打使其混合均勻”改為“在振蕩器上振蕩混勻”。
4、6.1.5中將“2~3個適宜稀釋度”改為“1~3個適宜稀釋度”，更加靈活，切合實際情況。允許只做1個梯度，減少了檢測的工作量，但對檢驗經驗和操作水平要求更高了，如果僅有的一個梯度出現多不可計或平行不好的情況則難以保證檢測結果的可靠性，此外如果出現樣本中抑菌物質造成的計數結果與稀釋度不成比例現象，也不容易發現，因此建議盡量采用2~3個稀釋度以規避可能的風險。
5、從此處開始，文中所有的“平皿”均替換為“培養皿”，更加規范和準確，但其他同時期發布的新標準中并未執行這一術語的統一。
6、6.1.6中的平板計數瓊脂溫度由“46℃”改為“46℃~50℃”，相應地，括弧內恒溫水浴鍋及其溫度均改為“恒溫裝置”和“48℃±2℃”。美國FDA BAM規定為45℃±1℃，ISO 4833-1：2013為44℃~47℃（將改為47℃~50℃）。在實際工作中，尤其是冬季氣溫較低的時候，考慮到傾注的時間，適當提高瓊脂的溫度使得更具可操作性。然而過高的溫度可能會對某些細菌造成損傷，影響結果，因此實驗室務必把握好尺度。
（二）培養
1、6.2.1這里的仍然沿用的“平板”而非之前的“培養皿”，是筆誤還是修訂者認為傾注了培養基的培養皿才能叫做平板呢？并且在段首的“待瓊脂凝固后”之前加了“水平放置”作為狀語進行修飾，強調了操作細節。
2、原來的6.2.2合并到了6.2.1的段末。
3、原6.2.2改為：“如果使用菌落總數測試片，應按照測試片所提供的相關技術規程操作”。這里所謂的技術規程，應該就是指的其使用說明書，市場上的測試紙片品牌較多，種類也較多，具體操作細節可能存在一定的差異性，實驗室應仔細閱讀說明書，建立作業指導書，對操作人員進行培訓和考核。
4、水產品的培養溫度和時間仍然保持不變，但在工作實踐中，檢驗員往往會對“水產品”指代的范圍產生困惑，新版標準能夠給與一個明確的定義和舉例就更好了。
（三）菌落計數
6.3.2中刪掉了段末的“每個稀釋度的菌落總數應采用兩個平板的平均數”，應該是避免與后面7.1.2中的公式應用產生歧義。
結果與報告
（一）菌落總數的計算方法：詳細規定了6種情形的菌落計算方法，并且還在附錄B中逐一提供了相應的案例，便于讀者理解。
（二）菌落總數的報告：刪掉了老版的“7.2.3 若所有平板上為蔓延菌落而無法計數，則報告菌落蔓延”，這是因為前文6.3.2已經明確要選擇“無蔓延菌落生長”的平板，故實際上已經明確蔓延菌落為不適合計數的情況，所以這句話是多余的。
主要參考文獻
[1]國家認監委辦公室關于公布2015年檢驗檢疫行業標準復審結論的通知
[2]微信公眾號：六扇門study——GB4789.2修訂一大亮點：增加測試片方法的并行準入
文章來源：網友Milonese原創分享，環凱小編轉載于食品微生物檢測公眾號！
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