“菌落總數測定”標準解讀，適合新手學習，老手自查！！
發布時間：2022-10-26 瀏覽次數：7408
一、 稱樣：
(1) 一般稱量25g，由于稱樣量較大，標準中對于稱樣的準確性未作出明確規定，微生物室常用稱樣的電子天平最大允許誤差為±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原則，即實際稱樣時可根據樣品情況稱取超出25g (如硬質糖果等，檢驗人員應依據樣品實際情況決定如何稱樣) ;
(2) 對于部分食品添加劑已明確須稱取1.0g的，則須嚴格精確稱量。
二、 樣品稀釋：
(1) 固體或半固體：稱取25g樣品于均質袋中，加入已滅菌的生理鹽水225g，稍捏碎（特別是糕點/面包及其他淀粉制品），放入拍擊式均質器均質 1min，此時即制備成 1：10 的樣品勻液。以滅菌移液器吸取該液體至 9mL 滅菌生理鹽水試管中，換上新的滅菌移液器槍頭，緩緩吸取液體后反復吹打 2次，此時即制備成 1:100 的勻液，以此類推，制備10倍系列稀釋勻液。
(2) 液體樣品：直接吸取原液進行檢驗，稀釋時可直接吸取1mL原液到9mL滅菌生理鹽水試管中按照“固體或半固體”的方式稀釋。
三、稀釋度的選取：液體樣品可直接取原液進行檢驗；固體或半固體則必須依據檢驗經驗，選取2-3個適宜稀釋度進行檢驗(一般樣品選取1: 10, 1: 100， 1: 1000三個稀釋度進行檢驗。若遇到不常做的樣品，可適當延長稀釋度至1: 100000 甚至1: 1000000)。
四、質量控制：空白對照：分別吸取1mL滅菌生理鹽水到平皿中做空白對照。（若空白有菌落生長則該實驗無效）。
五、平板計數瓊脂(PCA)：滅菌條件為121℃、15min。一般情況下于500mL敞口錐形瓶（三角瓶）中配制400mL/瓶。
六、有時樣品基質比較特殊，樣品勻液有細小的顆粒與菌落不易區分，此時可采用如下方法進行區分：
（1）配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液（又稱紅四唑或紅四氮唑，簡稱TTC），高壓滅菌后避光冷藏備用。紅四唑滅菌條件為：121℃、20min；
（2）待PCA瓊脂培養基冷卻至適宜傾注溫度時，無菌加入上述TTC溶液2mL，充分搖勻（此時PCA中TTC濃度為0.005%）。
加入TTC的目的及注意事項：培養后，菌落被TTC染成紅色，而樣品顆粒不變色，方便計數；PCA中TTC的濃度不宜過高，否則會抑制微生物的生長，對實驗結果產生影響。（特殊情況下方添加TTC，常規實驗無須添加，特別是對于菌落數量較少的樣品不宜添加。方法來源依據為《化妝品衛生規范》中菌落總數測定相關章節）
七、稀釋液：常采用0.85%氯化鈉溶液（生理鹽水），121℃、15min高壓滅菌后冷卻備用。
八、傾注培養基時，根據對樣品污染情況的估計（同一類型樣品的微生物檢測經驗），若樣品有表面蔓延生長的可能性，則待第一次傾注的瓊脂凝固后，可在表面再覆蓋一層瓊脂以避免菌落蔓延而難以計數。
九、水產品30±1℃培養72±3h；其它樣品36±1℃培養48±2h。注意：此處的“水產品”是指生魚片、魷魚干等未經深度加工的水產品。
十、本標準的重難點為菌落計數及計算。
除標準中已說明的要求外，有以下幾點需要注意：
（1）菌落計數時，從低稀釋度的平板開始計數。若所有平板上的菌落數均小于30CFU，則須計數所有平板上的菌落數，但僅采用最接近30CFU的兩個平板的菌落數來計算最終菌落總數。
以固體樣品舉例，菌落數選取、計算過程及結果修約如下：
（2）當第一稀釋梯度一個板上菌落數高于30，另一個低于30，則依據標準應當以介于30-300之間的菌落數作為該稀釋梯度的菌落數。（存在爭議，實際遇到該類情況時應謹慎對待）
以固體樣品舉例，菌落數選取、計算過程及結果修約如下：
（3）若所有平板上的菌落數均大于30CFU，則只計數30-300CFU之間的平板上的菌落數，并采用這些數據，依據標準中給定的公式，進行最終菌落總數的計算，此時將大于300CFU的記為“多不可計”，以“TNTC”表示。
以固體樣品舉例，根據標準中給定的公示，菌落數選取、計算過程及結果修約如下：
（4）若所有稀釋度的平板菌落數都大于300，則不能所有都計為TNTC，必須將最高稀釋度的兩個平板上的菌落逐一地計數，再計算平均數，該平均數為該梯度的菌落總數，其余平板上的菌落數可記為TNTC。
以固體樣品舉例，菌落數選取、計算過程及結果修約如下：
（5）計算菌落總數時，須嚴格按照標準要求進行計算。
特殊情況：
① 若所有平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數。“最低稀釋倍數”并不是固定不變的，與檢驗人員選取的稀釋度有關。如：某樣品多次檢驗后發現菌落總數較高，檢驗人員在梯度稀釋后取1:1000、1:10000、1:100000三個梯度的稀釋液傾注平板，最終所有平板上的均無菌落生長，則計算過程為＜1×1000，最終結果為＜1000CFU；若選取1:10、1:100、1:1000三個梯度的稀釋液傾注平板，均無菌落生長，則最終結果為＜10CFU。因此，稀釋度的選擇對于結果存在較大影響，選擇時應謹慎。
② 最低稀釋度兩個平板只有一個平板上長了1個菌落，若為固體樣品且本次檢驗的最低稀釋倍數為1:10，此時計算過程為（1+0）/2×10=5，由于默認固體樣品最小檢出量為10CFU，故本次檢驗的菌落總數結果為10CFU。注意：對于該情況一直存在爭議，不同的檢驗人員可能做法不一，有人保留為5CFU，有人保留為10CFU，并無固定做法。（建議檢驗人員保持一貫做法，不要隨意更改）
舉例如下：
十一、對于水產品、冷凍食品、速凍食品等菌落總數含量較高、限量值較大的食品類別，建議多增加稀釋梯度（可稀釋至10-4甚至10-5），避免稀釋度較低、濃度較大導致培養后平板上菌落蔓延、彌散而難以計數甚至無法計數。
來源：環凱轉載于食品鑫焱公眾號
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