研究生必備技能：細胞培養技巧（詳解）
發布時間：2023-02-22 瀏覽次數：2125
來源：科研小白的進階之路
“ 可能你已經是實驗室老江湖??了，但誰不希望自己細胞養的好看一些呢？本文適用于已經進入實驗室的小伙伴，沒有原理，都是干貨～ 建議認真閱讀！”
01 — 基礎操作
1. 適合慣用右手的超凈臺試劑布局
2. 對于新細胞心需要觀察摸索最適的消化溫度和時間，細胞間隙明顯，大片脫落可移動即可終止消化。有些細胞消化后不會變圓形，半沙狀即可；
3. 消化后需要輕輕拍打細胞壁面，震落細胞；
4. 離心速度不宜過大，1000rpm/min比較適宜
5. 離心后2 mL重旋，呈云霧狀散開即可，吹散次數過多影響細胞活力，建議熟練操作；
6. 種板需一步完成，不可補加；
7. 長時間培養實驗，最外圈應空出來，加入PBS或空白/陰性對照，以防培養基蒸發引起的邊緣效應；
8. 把從液氮或-70℃水箱中取出的細胞在最短的時間內放入水浴鍋中進行解凍。
9. 離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜（DMSO）濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少其對細胞的損傷。如果凍存液的濃度是10％ DMSO，那么加10 ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度。但培養基越少細胞越容易貼附。
10. 血清為混合物，不同品牌/批次存在差異，不同細胞適用血清品質存在差異，應做好細胞試用篩選工作，再囤積足夠量；胎牛血清在-20℃保存可達5年。
11. 血清滅活處理：4℃溶解，置于56℃ 30 mins.如果血清滅活后有纖維蛋白析出，屬正常現象；
12. 使用抗生素前，查詢細胞相關培養特性，根據污染類型的鑒別，有針對性的處理；
13. -80℃凍存效果有限，根據研究需求，合理凍存，半年以上實驗建議液氮凍存一批；
14. 根據不同的細胞類型選擇凍存的細胞密度。必要的實驗進行細胞最佳凍存密度測試。
典型的細胞凍存密度：1-10 ? 10^6 Cells/mL；
細胞長期高密度生長（長到90%-100%），更容易老化。且對數期細胞增殖速度快，容易聚團漂浮。應更具研究需要和細胞生長特性優化傳代密度。
15. 細胞一旦分化/老化，很難逆轉，無法通過外界營養體系和生長條件的改變“起死回生”。
16. 小心取用無菌實驗物品，勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，也不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
17. 每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同也不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以75%酒精擦拭無菌操作臺面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。
18. 離心管、凍存管等容器需用抗酒精的標記筆標示內容物名稱、操作日期、操作人員姓名。若是細胞傳代培養，更需注明目前的代數，以及這是同一代中的第幾盤。
19. 常用的生物安全柜應定期用75%酒精對內部工作區域表面、側壁、后壁、窗戶進行表面凈化；二氧化碳培養箱用75%酒精噴灑消毒后擦干（每月一次）；增濕盤換水（2周1次），蒸餾水漂洗后無紡布或紙擦干，用75%酒精噴灑消毒后擦干，可按比例添加Aquaguard-2支原體預防試劑（最好預熱至37℃）。顯微鏡、離心機也應定期擦拭。
20. 在開始養細胞并傳代時，也要特別注意凍存細胞，以保持細胞有種子庫存在，可以有效避免細胞損傷。
21. 胰酶細胞消化液消化細胞時間不宜過長，否則細胞鋪板后生長狀況會較差，做流式時的CD Marker也可能會下降。胰酶進行分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時液體體積會膨脹，多次使用同一瓶胰酶反復凍融會降低消化效果并可能造成污染。胰酶適用于消化細胞間質較少的軟組織和傳代細胞，如胚胎、上皮、肝、腎等組織，但對于纖維性組織和較硬的癌組織效果較差。胰酶消化效果主要與pH值、溫度、胰酶濃度、組織塊大小和硬度有關。
02 — 常見問題解答
1. 細胞鋪板后狀態不好：可通過更換其他批次細胞系，優化胰酶消化條件，血清中和量和時間改善；
2. 細胞鋪板不勻：消化過度容易造成細胞整片粘連，結團率高，很難通過吹打分散；不同細胞接種前，最好進行梯度吹打實驗；加樣從孔的左邊靠底部緩慢加入；
3. 每孔之間細胞量不同：鋪板速度盡量要快；每接幾個孔細胞懸液需要混勻一下；加完半邊板后，需要再次講培養皿內剩余細胞懸液充分混勻后鋪板。
4. 血清溶解后有絮狀物：冷凍血清應置于4℃冰箱溶解，期間需均勻搖晃，溶解后按需分裝凍存，避免反復凍融，不宜在4℃長期儲存。血清的顏色依據血紅蛋白含量不同而變化。
5. 細胞污染排查：培養試劑和輔助試劑等條件不變，重新復蘇一株細胞，復蘇時注意水浴不能沒過凍存管瓶蓋，傳代時不能觸碰吸管尖頭部或容器瓶口。操作前需要用75%的酒精擦拭無菌操作臺面。觀察細胞是否有污染現象。
血清污染排查：其他試劑不變，僅更換血清。
基礎培養基：其他試劑保持不變，僅更換基礎培養基。
PBS：其他試劑保持不變，僅更換PBS。
胰酶：若細胞復蘇的很好，一傳代就污染，可以嘗試其他試劑保持不變，僅更換消化用胰酶，看細胞狀態。
耗材：培養基及輔助試劑等條件不變，使用新耗材（培養皿或培養瓶、槍頭）培養細胞，觀察細胞是否有污染。
6. 細胞不貼壁：胰酶消化時間不當。時間短，易成團；胰酶處理太久，易造成細胞膜蛋白損傷，嚴重導致細胞死亡。
缺少貼壁因子：血清中含有促貼壁因子，無血清培養基，細胞貼壁效果下降很多。
其他原因：支原體或細菌污染；細胞狀態不好，細胞老化；接種細胞數目少；復蘇時處理速度太慢；培養液配制儲存不當（eg:pH過堿，Gln太少）。
解決方法：
貼壁變差：可適當加高血清比例（最高不超過20%）；建議試好一個血清批次多囤一些，可以避免血清批間差對細胞的影響。
7. 細胞老化怎么辦？
防止細胞老化最主要還是要做到勤觀察、勤換液、勤傳代、勤保種，特別是傳代，不能等細胞太密了之后傳，一般細胞建議長到70％融合度傳代最好；
換培養液應該根據自己細胞消耗培養基的情況來確定是否該換。如果感覺時間不好把握的話就多培養幾瓶細胞，在不同的時間換液，最后再來比較下，看什么時候換液好，得出自己的結論；
選擇正確的血清與培養基：細胞對血清特別敏感，直接影響細胞的生長。一定要選擇適合的血清不然就會因營養物質不協調而導致細胞老化；
在間充質干細胞培養時必然要進行消化，但是消化對細胞的表面蛋白質有很強的破壞作用，因此不能長時間進行消化并且在選擇消化酶時也要選擇較為合適的pH和濃度，不然就會使細胞老化或者分化；
8. 293細胞感染病毒后凋亡嚴重：
通過更換血清批次，再進行轉染實驗并觀察轉染后的效果，比較分析出原因。
293傳代：鑒于該細胞貼壁疏松，普通0.25%胰酶消化時間控制15s-30s；吹打動作輕柔，控制在10-20次；細胞融合率達到80%傳代即可傳代，不可長的太滿。
9. 血清渾濁怎么辦？
血清產品中出現沉淀屬于常見現象，無需過多擔心，并且不會影響血清的品質，對細胞培養而言也是沒有任何問題的，可放心使用。若想去除沉淀，我們建議您采用2000 rpm 離心5分鐘，或用0.45 μm的過濾器去除沉淀。
03 — 新手注意事項
1. 水浴鍋未提前預熱或者未預熱到37℃直接融化。
2. 水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。
3. 離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。
4. 一次復蘇細胞種類過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。
5. 判斷細胞復蘇成功與否，需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率。
定期檢查培養細胞的形態（即形狀和外觀）
① 細胞形態變化的跡象：細胞核旁顆粒的堆積、細胞質中有空泡、細胞團縮并從平板上脫離、外形變化
② 細胞形態變化原因：培養基改變、細胞污染、細胞老化、有毒物質
PH值降升高：
完全培養基盡量現配現用，2~8℃下避光保存一周內使用完；避免操作時間過長。操作時間快速、減少同時進行的實驗數量。
PH值降低：
① 及時傳代、提高傳代比例或降低血清量；
② 適當松開瓶蓋；
③ 增加培養液中NaHCO3濃度或減少培養箱內CO2濃度（NaHCO3含量在2.0 g/L到3.7 g/L之間時，對應的CO2濃度為5~10%）；
④若是微生物污染造成的，需及時丟棄培養基，并對操作、培養空間進行消毒處理。
引用??：[1] 本文內容來自于逍鵬生物，逍鵬生物對外泌體和細胞3D培養有相關經驗分享。
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