培養液酸堿度（pH）對細胞培養的影響
發布時間：2023-07-14 瀏覽次數：8663
維持細胞正常的生理活動，需要細胞膜內外的物質交換。在這一過程中，細胞膜內外的離子濃度及差異具有重要的生理意義。它不僅調節存在于細胞膜和細胞器上的質子依賴性轉運蛋白的活性，而且還影響脂質和蛋白質等細胞內的生化反應。
由于這一生物學過程受酸堿平衡的影響較大，并極其敏感，因此，在細胞培養過程中，培養液的pH值必須維持在適宜水平，并能隨著時間的推移保持穩定。
目前，大多數（但不是全部）細胞培養液采用碳酸鹽緩沖體系，以控制和穩定pH值，通常通過添加一定量的碳酸氫鈉來實現。在生物體內，碳酸鹽-二氧化碳（CO2）緩沖系統可以由肺（CO2）和腎臟（碳酸氫鹽）來主動調節，使pH值保持在一個最佳水平，而在細胞培養中，培養箱中的二氧化碳可與培養液中的碳酸氫鹽共同作用，以實現這一目的。
不同動物細胞適用的培養液pH值有所不同，多數哺乳動物細胞在pH值為7.2-7.4時生長良好。當然，這是理想數值，在實際工作中，會發現細胞培養液的pH值會隨著時間發生變化。比如，在不更換培養液的情況下，細胞培養一段時間后，會注意到培養液變為橙黃色。
顏色上的變化，來源于培養液中添加的pH指示劑 — 酚紅。含有酚紅的溶液在pH值為6.8及以下時呈現黃色。隨著pH值的上升，顏色會逐漸變紅，直至達到7.6 時，溶液呈現出粉紅色，在pH值為8.2以上時又變成明亮的紫紅色（見下圖）。這些可視化的改變，可幫助我們快速判斷細胞的生長情況。
（Phenol red, 40 μM: colors in cell culture medium at a pH range from 6.0 to 8.0 Created by Max Schwalbe）
一般來說，培養液呈橙紅色，這是哺乳動物細胞生長的健康的pH值條件，此時pH值為7.0-7.7。如果顏色呈亮黃色（過酸）或紫紅色（過堿），說明細胞生長出現了狀況。
一方面，培養液通常會或多或少的酸化。細胞生長過密或時間過長，酸性代謝產物累積會導致培養液pH值下降；此外，若培養液被細菌和酵母菌污染且過度生長，pH值也會下降；而低氧條件下的培養液pH值也會降低，因為低氧環境促進了細胞代謝的乳酸堆積。
另一方面，當培養液開封后在冰箱中放置的時間過長，或者培養箱中的二氧化碳水平降低，會觀察到培養液變成紫紅色，此時，培養液的pH值升高。
實際上，培養液中基于碳酸鹽的緩沖體系是為培養箱中特定的CO2水平而配制的。一些細胞類型可能更喜歡培養液中更高或更低的碳酸氫鹽濃度，這就要求在細胞培養液的孵化過程中采用更高或更低的CO2濃度，以維持生理上的pH值。
由于室內空氣中的CO2含量要低得多（低于1%），即使是輕微的干擾，例如打開培養箱的門，也會導致培養箱內CO2水平的改變。與此同時，由于水的解離常數會隨著溫度的降低而降低，都會對培養液的pH值造成影響。
因此，基于讓細胞和培養液保持在恒定的CO2濃度和溫度下的原則，在培養箱外進行細胞操作時，應盡量減少操作時間，在從培養箱取出細胞之前，應準備好細胞操作需要的其他材料，同時，培養液溫度至少要恢復到室溫，以減少細胞對低溫的應急反應。
為減少CO2水平以及溫度變化給培養液和細胞帶來的影響，在培養箱外處理細胞時，可考慮使用添加非碳酸鹽緩沖劑（如HEPES緩沖液）的培養液。
HEPES的解離常數隨著溫度的下降而下降，這點與水類似，這種特性使得HEPES緩沖體系更適應培養箱外的室溫環境和較低的CO2水平，這在維持細胞生理功能方面優于碳酸鹽緩沖體系。但如果培養液長時間接收光照，HEPES會與培養液中的色氨酸及其他成分發生反應，產生對細胞有害的活性氧（自由基），影響細胞的正常生理功能。因此使用含有HEPES的培養液，最好將培養液瓶用鋁箔紙覆蓋以避免光照。
基于上述原因，除非必要，盡量不要使用含有HEPES的培養液，尤其在CO2培養箱中培養細胞時。盡管含HEPES的培養液能夠維持更恒定的pH值，即使細胞過度增殖，培養液也不容易變黃，但這并非使用含HEPES培養液的目的。恰恰相反，加入酚紅指示劑的目的之一就是通過培養液的顏色變化來及時了解細胞的生長狀態，從這個角度考慮，含HEPES的培養液也不適合用來長期培養細胞。
簡言之，細胞培養，就是要為細胞提供最適宜的生長環境，以保持細胞培養初始時的群體狀態。這個要求苛刻而必要，需要從業者近乎呆板的堅守各種常規、操作細節，科研不易，堅守也是把鑰匙。
來源：“信睿生物”公眾號
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