原代細胞培養技巧和竅門
發布時間：2023-07-21 瀏覽次數：1018
原代細胞（Primary cells）是指來源活體組織，經過特定分離方法制備而成的初始細胞。
原代細胞離體時間短且不經過永生化過程，其生物學特性未發生很大變化，仍保持原有的遺傳特征，可更好地反映細胞在體內的生長狀態，從而獲得與體內生理功能更接近的數據，很適合用于藥物測試、細胞分化和轉化等實驗研究。
原代細胞培養技巧
1. 生長需求（Growth Requirements）
原代細胞可以懸浮培養或貼壁培養。一些細胞自然地懸浮在懸浮液中，而不附著在表面上（例如，來源于外周血的細胞）。也有一些細胞系經過修飾可以在懸浮培養中存活，它們的生長密度高于粘附條件所允許的密度。對于依賴貼壁的原代細胞，貼壁細胞（例如實體組織）需要一個表面才能在體外正常生長。
這些細胞大多在沒有涂層的扁平塑料容器中培養，但有時在微載體上培養，可以用細胞外基質蛋白（如膠原蛋白和層粘連蛋白）包被，以增加粘附特性并提供生長和分化所需的其他信號。細胞培養基由補充了適當的生長因子和細胞因子的基礎培養基組成，細胞在細胞培養箱中生長，并維持在適當的溫度和混合氣體中（對于哺乳動物細胞，通常為37°C，5％CO?）。培養條件根據細胞類型而廣泛變化，生長培養基的pH、葡萄糖濃度、生長因子和其他營養物質的存在可能會有所不同，具體取決于細胞類型。
在建立原代培養過程中，必須在生長培養基中加入抗生素以抑制從宿主組織引入的污染。抗生素可能包括慶大霉素，青霉素，鏈霉素和兩性霉素B的混合物。但是，不建議長期使用抗生素，因為某些試劑（例如兩性霉素B）從長期來看可能對細胞有毒。
分離后保留原代細胞的活力非常重要，因為它們中的大多數會經歷衰老過程，并在一定數量的種群倍增后停止分裂。為了使細胞長期存活，必須具備出色的細胞培養操作技能以及適當的培養條件（即生長培養基、溫度、氣體混合物、pH、生長因子濃度、營養物質和葡萄糖等）。用于補充培養基的生長因子通常來自動物血液（血液來源的成分具有污染的可能性），建議盡可能減少或消除這些成分的使用，操作時也需要使用無菌技術。
2. 細胞融合（Cellular confluence）
細胞融合通常是指附著的細胞在培養容器中所占的百分比。例如，100％的細胞融合意味著培養皿表面被細胞完全覆蓋，而50％的細胞融合意味著大約一半的表面被覆蓋。跟蹤和評估原代細胞培養是一個重要且必不可少的參數，因為各種細胞類型需要不同的融合終點，此時需要對其進行傳代培養。
3. 繼代保持（Maintenance and Subculture）
當分離的細胞附著在培養皿表面時，細胞的維持階段開始。通常，培養開始后約需要24小時。當細胞達到所需的細胞融合百分比并活躍增殖時，就該進行傳代培養了。這是在達到100％融合之前傳代原代細胞培養的最佳時間，因為融合后的細胞可能會發生分化，并在傳代后顯示出較慢的增殖。
依附依賴性細胞以單層生長，需要定期用適當的培養基傳代培養以維持指數生長。單層的繼代培養涉及細胞間和細胞內表面間鍵的斷裂，大多數粘附的原代細胞需要消化它們的蛋白質附著鍵，或者需要用低濃度的蛋白水解酶（例如胰蛋白酶/ EDTA）從單層或相關組織中分離出來。細胞解離并分散成單細胞懸液后，將它們計數并稀釋至適當的濃度，然后轉移至新鮮的培養容器中（培養基的組成取決于細胞類型而有所不同），在此處它們會重新附著并分裂。
4. 細胞計數（Cell counting）
血細胞計數器通常用于使用排阻染料錐蟲藍估計細胞數和確定細胞活力。血細胞計數器是相當厚的玻璃顯微鏡載玻片，帶有矩形凹痕，可形成一個腔室。腔室上刻有垂直線的激光蝕刻柵格，并且精心制作了該設備。由線界定的面積和腔室的深度是已知的。因此，可以對特定體積的流體中的細胞數進行計數，從而計算出整個流體中的細胞濃度。
5. 冷凍保存和恢復（Cryopreservation and Recovery）
低溫保存是使用低溫保存結構完整的活細胞的過程。冷凍保存和融化原代細胞是必不可少的，以最大程度地減少每個過程中的細胞損傷和死亡。對于原代細胞，可通過使用冷凍保護劑（例如DMSO或甘油，在正確的溫度和受控的冷凍速率下）實現。對于大多數原代細胞，可以在80％完全生長培養基的混合物中添加10％FBS和10％DMSO進行冷凍保存。冷凍過程需要以每分鐘-1°C的速度緩慢進行，以最大程度地減少細胞內冰晶的形成。冷凍的培養物需要以液氮（-196°C）或低于-130°C的氣相存儲。
解凍冷凍保存的細胞是快速的過程，方法是將冷凍的細胞浸入37°C水浴約1-2分鐘。注意不要在融化后離心原細胞（因為它們對冷凍保存恢復過程中的損傷極為敏感）。最好在融化后直接鋪板細胞，并允許培養物在最初的24小時內附著。當啟動冷凍保存的原代細胞培養時，必須在細胞附著后去除用過的培養基（因為DMSO對原代細胞，并可能導致解凍后活力下降）。
原代細胞培養過程中可能存在的錯誤
污染：轉移主要組織進行培養時需要注意避免污染。
pH值變化：這可能是由于培養基中的鹽分不正確，細菌或真菌污染，碳酸氫鹽緩沖液不足，二氧化碳張力不正確等引起的。
粘附性不足（細胞不貼壁）：培養基中不含附著因子（attachment factors）或附著因子不足，培養皿或培養基污染，細胞被胰蛋白酶過度消化等。
生長緩慢：原因包括培養基的pH值變化，必需的促進生長的成分/因子耗盡，低污染，試劑儲藏不當等。
細胞死亡：溫度波動，二氧化碳含量過低，在融化和/或冷凍保存過程中細胞受損，有毒代謝產物濃度增加，培養基中的滲透壓失衡導致細胞存活率降低。
沉淀（pH不變）：由于使用了冷凍培養基，在pH不變的培養基中可能會出現沉淀，殘留的磷酸鹽殘留在用洗滌劑洗滌時可能會沉淀出粉末狀的培養基成分。
細胞結塊（細胞不貼壁且結塊）：懸浮細胞可能由于鈣、鎂離子的存在（貫流時應使用不含鈣、鎂離子的D-Hank’s緩沖液（D-HBSS），而不能選擇含有鈣、鎂離子的HBSS或可能含有鈣、鎂離子的PBS緩沖液）或細胞裂解及DNA釋放（過度用蛋白水解酶消化）而結塊。
誘導變異性：多種試劑和培養基會誘導原代細胞的數據產生變異，研究者的處理手法也可能導致原代細胞的數據產生變異。
來源："東創實驗科研服務"公眾號
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