據世界衛生組織估計，致病菌是引發食源性疾病的主要因素，占比高達70%。而食源性致病菌易通過食品生產、加工、運輸、銷售等環節對以肉、蛋、奶及其制品為代表的動物性食品造成污染。因此，食源性致病菌的早期篩查和超靈敏檢測是保障食品安全的關鍵環節。基于新型Argonaute(Ago)酶實現對食源性致病菌的“火眼金睛”識別，豐富了超靈敏檢測細菌的工具箱。
傳統的食源性致病菌的檢測方法
前食源性致病菌的檢測方法主要包括傳統培養法、核酸擴增方法如聚合酶鏈式反應(PCR)、重組酶聚合酶擴增 (RPA)、環介導等溫擴增(LAMP)、免疫學方法等。然而，這些方法受限于流程復雜、耗時長、依賴大型儀器、缺乏終點檢測、攜帶污染、非特異性擴增等。
新型Ago酶的出現
Ago酶作為一種程序性、靶激活的核酸酶，是一種高度保守的蛋白，在真核生物和原核生物中都具有防御和調節功能。Ago酶可以使用互補的單鏈“向導RNA(gDNA)”或基于Watson-Crick堿基配對的“gDNA”來切割侵襲性RNA或DNA。真核Ago酶 (eAgos)主要參與RNA干擾，而原核Ago酶 (pAgos)主要通過DNA干擾參與宿主防御。pAgo的識別和切割是由DNA或RNA引導的，但不限于目標中的PAM序列。
基于Ago酶的“火眼金睛”如何精準識別食源性致病菌？
首先研究人員利用標簽特異性引物實現對傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性基因的擴增，擴增得到的產物會作為阿爾戈瑙熱球菌Ago（Pyrococcus furiosus Argonaute, PfAgo酶的gDNA，從而可以促進PfAgo酶識別并切割兩端分別連接有熒光信號和熒光猝滅劑的基因，使得熒光信號迅速增強，從而可以通過“火眼金睛”快速識別熒光信號，實現對食源性致病菌的定量監測。
基于Ago酶的“火眼金睛”的食源性致病菌精準識別的優勢
如圖一所示，基于Ago酶的“火眼金睛”的食源性致病菌精準識別是通過結合tag特異性引物，核酸外切酶(Exo I)和PfAgo，在沒有引入多個gDNA的情況下進行的一步切割。此外，Tag序列和報告基因具有通用性和無重構性。其他食源性致病菌的檢測只需設計相應的引物即可。方案1B和1C顯示了以往基于ago的檢測和基于pcr的檢測的一般原理，則沒有該方法的優勢。
Figure 1. Schematic diagram of the proposed NOTE-Ago assay based on PfAgo system (A), previous Ago-based detection (B) and PCR-based detection (C).
關鍵發現
● 基于Ago酶的“火眼金睛”的食源性致病菌精準識別將tag特異性引物和PfAgo相結合，實現對傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等食源性致病菌的超敏感檢測
● 基于Ago酶的“火眼金睛”的食源性致病菌精準識別具有在多重病原菌中區分檢測靶點的能力。
研究前景：
這項研究擴展了基于Ago酶的檢測工具箱，提出了一種新型的、無需重建的食源性致病菌檢測平臺，具有簡單、靈敏、準確的特點，并具有多重檢測的潛力。參考來源：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2023.131485
來源：微生物安全與健康網，作者~高翔。
