SN/T 0176-2013 出口食品中蠟樣芽胞桿菌檢測  操作步驟

第一法   蠟樣芽胞桿菌平板計數法

1 蠟樣芽胞桿菌檢測

1.1 樣品的稀釋

1.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g樣品置于盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或0.85 %生理鹽水的無菌均質杯中，以8000 r/min~10000 r/min的轉速勻質1 min~2 min，或放入盛有225 mL稀釋液的無菌均質袋中，用排擊式均質器拍打1 min~2 min，制成1:10樣品勻液。

1.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置于盛有225 mL磷酸緩沖液或0.85%生理鹽水的無菌稀釋瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中充分混勻，制成1:10樣品勻液。

1.1.3 用1 mL的無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，加到盛有9 mL磷酸緩沖液或0.85 %生理鹽水的試管中，充分混勻，制成1:100的樣品勻液。

1.1.4 按1.1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液，直至適宜稀釋倍數。

1.2 樣品的接種

根據對樣品污染狀況的估計，選擇2~3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取0.1mL樣品勻液加入MYP平板瓊脂平板，然后用無菌L棒均勻涂布于整個平板，注意不要觸及平板邊緣，每個稀釋度接種兩個MYP瓊脂平板。

1.3 培養

1.3.1 在通常情況下，涂布之后將平皿靜置10 min~30 min，待樣品勻液吸收后翻轉平板，30℃±1℃培養24 h。如果培養物的菌落特征不顯著，則繼續培養至48 h。

1.3.2  蠟樣芽胞桿菌在MYP瓊脂平板上生長的典型菌落為直徑2 mm~5 mm，菌落表面粗糙，在深紅色背景下呈現粉紅色或微粉紅色，環繞產生5 mm寬的卵磷脂酶沉淀環。沒有根狀生長的特性（蕈狀芽孢桿菌形成根狀生長的特征）。

1.4 菌落計數

選取菌落數在15 CFU~150 CFU的典型或可疑蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，進行計數。

注：如果有很多發酵甘露醇的細菌，會影響到典型菌落，使之減少或消失。少量的蠟樣芽胞桿菌無卵磷脂酶沉淀環，這些菌同樣需要證實實驗。

1.5 營養瓊脂斜面或平板培養基

從每個平板上挑取5個典型菌落，如無典型菌落，則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，分別接種于營養瓊脂斜面或平板，30℃±1 ℃培養24 h，取培養物進行革蘭氏染色和證實實驗。

1.6 證實實驗

1.6.1 葡萄糖發酵實驗：將培養物接種到酚紅葡萄糖肉湯中，置于厭氧培養箱中36 ℃±1 ℃培養24 h，振搖后肉湯由紅變黃，表明在厭氧條件下蠟樣芽胞桿菌分解葡萄糖產酸。

1.6.2 硝酸鹽還原實驗：將培養物接種到硝酸鹽肉湯中，36 ℃±1 ℃培養24 h，加0.25 mL亞硝酸鹽試劑A和0.25 mL亞硝酸鹽試劑B，在10 min內變為紅色為陽性反應。

1.6.3 改良V-P實驗：將培養物接種到改良V-P培養基中，36 ℃±1 ℃培養24 h，取1 mL培養物置于滅菌空管中加入0,2 mL40 %KOH溶液和0.6 mL5%α-萘酚乙醇溶液和少量結晶肌酸。靜置1 h出現伊紅粉紅色為陽性。

1.6.4 L-酪氨酸分解實驗：將培養物接種到L-酪氨酸瓊脂培養基上，36 ℃±1 ℃培養48 h在靠近菌落生長的地方培養基為透明的，則表明酪氨酸被分解，陰性則繼續培養至72 h，結果仍為陰性的棄去。

1.6.5 溶菌酶試驗：將培養物接種到0.001%溶菌酶營養肉湯中，另取培養物接種到普通營養肉湯中作為對照，36 ℃±1 ℃培養24 h，蠟樣芽胞桿菌在本培養基中能生長，為陽性反應。如出現陰性反應繼續培養 24 h，結果仍為陰性棄去。

1.6.6 符合MYP瓊脂上的典型菌落形態，鏡檢為革蘭氏染色陽性大桿菌，呈鏈狀，芽胞呈橢圓形位于菌體中央或偏端，并且在厭氧條件下發酵葡萄糖產酸，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，改良V-P試驗陽性，分解L-酪氨酸，能在0.001%溶菌酶中生長的進行如下實驗：

1.6.7 蠟樣芽胞桿菌與類似菌的鑒別試驗：

動力實驗：用接種針挑取培養物穿刺接種于動力培養基中，30 ℃±1 ℃培養24 h。有動力的蠟樣芽胞桿菌應沿穿刺線呈擴散生產，而蕈狀芽孢桿菌常呈“絨毛狀”生長。

溶血試驗：將疑似菌點種在綿羊血瓊脂表面，30 ℃±1 ℃培養24 h。蠟樣芽胞桿菌會觀察到強烈的β-溶血反應。蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌呈現弱溶血現象，而炭疽芽孢桿菌通常為不溶血。

蛋白毒素結晶試驗：取經30 ℃±1 ℃培養24 h并于室溫放置2 d~3 d的營養瓊脂培養物少許于載玻片上，用滅菌蒸餾水做顯微涂片。待干燥后將涂片慢慢通過火焰，短暫加熱固定。待冷卻后，用甲醇蓋滿涂片，30 s后棄去甲醇，通過火焰使其充分干燥，再將涂片蓋滿0.5 %堿性復紅水溶液或石碳酸復紅ZN染色液。用微火輕輕從底部加熱玻片至產生蒸汽為止。過1 min~2 min，再重復這個步驟。靜置30 s，棄去染液。用蒸餾水充分沖洗玻片，待其自然干燥。在顯微鏡油鏡下觀察是否有游離的芽孢和毒素晶體。如果未見游離芽孢，可將培養物在室溫下多放置幾天后進行試驗。蘇云金芽胞桿菌產生四角晶形（菱形）的暗色蛋白毒素晶體，蠟樣芽胞桿菌不產生毒素晶體。

1.6.8 符合蠟樣芽胞菌群特征的，呈強烈溶血，有活潑的動力，不產生蛋白毒素結晶的培養物，可確定為蠟樣芽胞桿菌。

1.7 可替代的生化實驗

如選擇API 50 CHB生化鑒定試劑盒或VITEK全自動微生物鑒定系統，可按照1.5從營養瓊脂斜面或平板上挑取培養物，用生理鹽水制備成濁度適當（根據儀器要求）的菌懸液，使用API 50 CHB生化鑒定試劑盒或VITEK全自動微生物鑒定系統進行鑒定。

2 結果計算

2.1 平板上的有效菌落數的計算見式（1）

a=b/A*C················（1）

式中：

a——平板上的有效菌落數；

b——根據證實實驗確定為蠟樣芽胞桿菌的菌落數；

A——進行證實實驗的菌落數；

C——平板上的菌落數。

同一稀釋度有效菌落數的平均值計算公式見（2）

···············（2）

式中:

——同一稀釋度有效菌落數的平均值；

——同一稀釋度有效菌落數的和。

若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按（3）計算：

················（3）

N——樣品中蠟樣芽胞桿菌數；

——連續兩個稀釋度的有效菌落數的平均數之和；

V——加樣量（0.1 mL或1 mL）;

d——連續兩個稀釋度中較低的稀釋度。

例：將檢樣1^0-5、10^-6連續兩個梯度稀釋液0.1 mL涂布于MYP瓊脂平板上，生成的疑似蠟樣芽胞桿菌菌落數分別為137、148和21、17個，各取5個進行鑒定，證實為蠟樣芽胞桿菌的分別為3、4和4、4個，則每一稀釋度的有效菌落數的平均數分別為100、15 CFU。則1 g樣品中蠟樣芽胞桿菌數為：

(100+15)/(0.1*11*10^-3)=115/(1.1*10^-6)) =1.0×10⁸ CFU/g

2.2 若同一稀釋度屁股辦上只有一個平板菌落在適宜范圍之內，則計算此平板的有效菌落數，然后與其相鄰稀釋度的有效菌落數的平均值求和，再通過式（3）計算求值，即為每克（或毫升）中蠟樣芽胞桿菌。

2.3 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜范圍內，計算此稀釋度的有效菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數再除以加樣量，即為每克（或毫升）中蠟樣芽胞桿菌數。

2.4 若所有稀釋度的平板上菌落數均大于150 CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數，計算此稀釋度有效菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數再除以加樣量，即為每克（或毫升）樣品中蠟樣芽胞桿菌數。

2.5 若所有稀釋度的平板菌落數均小于15 CFU，則對稀釋度最低的平板進行計數，計算此稀釋度有效菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數再除以加樣量，即為每克（或毫升）樣品中蠟樣芽胞桿菌數。

2.6 若所有稀釋度的平板菌落數均不在15 CFU~150 CFU之間，其中一部分小于15 CFU而另一部分大于150 CFU時，則最接近15 CFU或150 CFU的平板進行計數，計算此稀釋度有效菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數再除以加樣量，即為每克（或毫升）樣品中蠟樣芽胞桿菌數。

3 蠟樣芽胞桿菌平板計數的報告

根據MYP瓊脂平板上蠟樣芽胞桿菌的典型菌落數，按2中公式計算，報告每克（或毫升）樣品中蠟樣芽胞桿菌數，以CFU/g（或CFU/mL）表示；如果最低稀釋倍數的兩個培養皿均沒有菌生長則結果可表述為每克（或毫升）樣品中蠟樣芽胞桿菌數小于1乘以最低稀釋倍數（如果是液態樣品的原液，則結果可以表述為每毫升樣品中蠟樣芽胞桿菌數小于1）。

第二法   蠟樣芽胞桿菌MPN計數

3檢驗程序

3.1 蠟樣芽胞桿菌MPN計數法檢驗程序見圖2

3.2 MPN計數法試用于蠟樣芽胞桿菌數≤10³/g的情況

4 操作步驟

4.1樣品的稀釋

樣品的稀釋按1.1進行.

4.2樣品的接種和培養

每個樣品選擇三個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可選擇原液），每個稀釋度接種3管已酪胨大豆多粘菌素肉湯（TSPB），每管接種1 Ml.（如果接種量超過1 mL，則用雙料 TSPB，每管接種10 mL），30 ℃培養48 h。

4.3 分離

從出現渾濁的試管取培養物劃線接種到MYP瓊脂上，30 ℃±1 ℃培養24 h。如果培養物特征不顯著，可延長培養24 h。蠟樣芽胞桿菌在MYP 瓊脂平板上典型的菌落為表面粗糙，在深紅色背景下呈現粉紅色或微粉紅色，環繞產生5 mm寬的卵磷脂酶沉淀環，沒有根狀生長的特性。

4.4 營養瓊脂斜面或平板培養

從每個MYP瓊脂平板上挑取5個典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸 菌落中心部位，分別接種于營養瓊脂斜面或平板，30 ℃±1 ℃培養24 h，取培養物進行革蘭氏染色和證實實驗。

4.5證實實驗

證實實驗按1.6、1.7進行。

5 蠟樣芽胞桿菌MPN計數結果報告

根據證實實驗確定為蠟樣芽胞桿菌的管數，只要有1個菌落鑒定為蠟樣芽胞桿菌，其所代表的TSPB管即為蠟樣芽胞桿菌陽性。依據TSPB陽性管數查MPN表（見行標附錄B），報告每克（或毫升）樣品中蠟樣芽胞桿菌MPN值。

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